從RNA提取到Real Time PCR

2022-03-01 17:16

背景介紹

核糖核酸（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物細(xì)胞（主要分布在細(xì)胞質(zhì)中）以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體，是以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá)，是遺傳信息向表型轉(zhuǎn)化過程中的橋梁。

實(shí)驗(yàn)流程

一、細(xì)胞RNA的提取

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫，RT－PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

實(shí)驗(yàn)所需試劑和材料：Trizol（4℃保存）、無水乙醇、氯仿（三氯甲烷）、DEPC水、異丙醇（－20℃預(yù)冷備用）、移液槍槍頭（RNase－free）、 EP管（RNase－free）。

實(shí)驗(yàn)操作流程：

1．樣品準(zhǔn)備：將細(xì)胞接種于6孔板中，經(jīng)干擾和加藥處理后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加1mL處理細(xì)胞用PBS漂洗細(xì)胞兩次。每孔加1 mL TRIzol Regent，4℃；

2．裂解20 min 裂解細(xì)胞。之后用移液器輕輕吹打，使裂解物均勻，并用移液器轉(zhuǎn)移至 RNase－free的1．5 mL離心管中，可放于－80℃保存；

3．超凈臺(tái)臺(tái)面，實(shí)驗(yàn)所需材料用75％酒精擦拭并紫外照射30min滅菌。通風(fēng)10min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；

4．冰上完全溶解樣品，向每管裂解物中加入200 μL氯仿，蓋好管蓋，上下輕輕顛倒混勻20s，冰浴 5 min；

5．混合物置于 4℃，12000 r／min離心15 min；吸棄上清，置于超凈臺(tái)中室溫放置15 min；

6．離心后，樣品分為三層，上層水相為RNA，中層沉淀為蛋白質(zhì)和DNA，下層為多糖等。小心吸出上層水相400μL（400μL就夠了，建議切勿貪多），轉(zhuǎn)移到新的EP管中；

7．每1 mL裂解物加400 μL預(yù)冷的異丙醇，輕柔顛倒混勻15 s后置于－20℃、1 h沉降RNA；

8．－20℃沉降 1 h 后，沉降體系于4℃，12000 r／min 離心10 min。后打開離心管蓋，將離心管放平，小心傾倒其中液體，保留沉淀；

9．每管1 mL 預(yù)冷的 75％乙醇溶液，蓋好管蓋，用力震蕩離心管懸浮沉淀，漂洗沉淀。后于 4℃ 13000 r／min 離心 10 min，吸棄上清，保留沉淀；

10．吸棄上清的離心管倒置于超凈工作臺(tái)中，風(fēng)干10 min；

11．每管加入適量DEPC處理水，溶解RNA沉淀；

12．利用超微量核酸定量儀測(cè)定RNA濃度。

注意事項(xiàng)：RNA易分解，實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺(tái)進(jìn)行是不需要點(diǎn)燃酒精燈，需避火操作。RNase酶是導(dǎo)致RNA降解的最主要的物質(zhì)，可以水解RNA的磷酸二酯鍵，廣泛存在于人的皮膚上，因此，在RNA制備有關(guān)的分子學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套，并且RNA提取實(shí)驗(yàn)中所使用的移液器和EP管需是RNase－free物品。由于DEPC的劇毒性，實(shí)驗(yàn)室是現(xiàn)在一般槍頭與EP管高壓滅菌3次以上。DEPC水現(xiàn)可由市面上的無菌水／RNase－free水代替。

二、運(yùn)用M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

利用Promega 公司生產(chǎn)的M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系為2 μg RNA，25 μL體系實(shí)驗(yàn)試劑：dNTP（4 ℃保存），M－MLV（－20 ℃保存），RNasin（－20 ℃保存）。

1．超凈臺(tái)中取EP管進(jìn)行標(biāo)注，按照?qǐng)D1，每管加入5 μL的隨機(jī)引物，同時(shí)加入2 μg的RNA模板，混勻后置于70℃的恒溫孵育器中5 min，使得隨機(jī)引物與模板鏈孵育結(jié)合，然后迅速置于冰上進(jìn)行冷卻；

2．每管按照5 μL 10 M的dNTP、5 μL的5×Buffer、0．625 μL的RNase inhibitor? 以及1 μL的M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（酶放置于冰盒中）配制成預(yù)混液，分裝至每個(gè)EP管，用DEPC水補(bǔ)齊至終體積25 μL；

3．漩渦震蕩混勻離心之后，置于37℃恒溫孵育器中孵育1 h；

4．調(diào)節(jié)溫度至70℃終止反應(yīng)，10min，得到的cDNA至－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｄ孓D(zhuǎn)錄的過程中需操作迅速、謹(jǐn)防污染；需注意cDNA 不穩(wěn)定，切勿反復(fù)凍融。

三、實(shí)時(shí)定量PCR

常規(guī)PCR中，擴(kuò)增產(chǎn)物（擴(kuò)增子）是通過終點(diǎn)法來分析檢測(cè)，即 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行成像分析。而熒光定量 PCR 可以在反應(yīng)進(jìn)行過程中進(jìn)行累積擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和檢測(cè)，即“實(shí)時(shí)”。

在反應(yīng)體系中加入熒光分子，通過熒光信號(hào)的按比例增加來反應(yīng) DNA 量的增加，使 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)成為可能。利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量。RT－PCR技術(shù)可用于檢測(cè)細(xì)胞和組織中基因表達(dá)水平，克隆特定基因 cDNA序列和檢測(cè)RNA病毒。

（1）實(shí)時(shí)定量PCR具體操作：

按照?qǐng)D中體系在1．5 mL的EP管中配制反應(yīng)預(yù)混物，漩渦震蕩混勻之后，按照預(yù)先安排的順序分裝至八連管中。分裝至八連管之后按照循序加模板，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，樣品每組做3個(gè)平行，并根據(jù)引物的數(shù)量設(shè)置陰性對(duì)照。預(yù)混應(yīng)體系配制過程中全程避光，配好以后置于掌式離心機(jī)離心數(shù)秒，使所有組分沉降于八連管底部。錫箔紙包住EP板，轉(zhuǎn)移至Real time PCR反應(yīng)儀器中，設(shè)置反應(yīng)程序后，點(diǎn)“Start”啟動(dòng)反應(yīng)。

（2）連機(jī)依次設(shè)置參數(shù)如下：

a、StepOne Instrument（48 wells）：根據(jù)儀器規(guī)格選擇48孔／96孔；

b、Quantitation（相對(duì)定量）：選擇相對(duì)定量的方式，目的基因與內(nèi)參基因Ct數(shù)值；數(shù)值；

c、Comparative（△△Ct）：采用△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；

d、SYBR Green：所選試劑中的熒光染料為SYBR Green；

e、cDNA：選用的模板為cDNA，進(jìn)行特異性的擴(kuò)增；

f、輸入待測(cè)靶基因的數(shù)目同時(shí)輸入相應(yīng)靶基因名稱；

g、輸入待測(cè)樣品的數(shù)量、設(shè)置平行性個(gè)數(shù)、靶基因的陰性對(duì)照及相應(yīng)的待測(cè)樣品的名稱；

h、設(shè)置樣品中的control組及陰性對(duì)照組；

i、實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)條件如下表所示。

Stage 1

預(yù)變性

Stage 2

PCR反應(yīng)

Stage 3

溶解曲線

95℃ 2 min

95℃ 10 s

60℃ 30 s

40個(gè)循環(huán)

95℃ 1 min

55℃ 1 min

95℃ 15 s

正確的實(shí)驗(yàn)技巧是成功的熒光定量 PCR 反應(yīng)重要然而常被忽視的要素。為得到最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)人員要盡可能減少樣品間交叉污染的可能，避免將核酸從一個(gè)實(shí)驗(yàn)帶入下一個(gè)實(shí)驗(yàn)。以下措施有助于避免實(shí)驗(yàn)污染問題：

? 在樣品準(zhǔn)備和配制反應(yīng)液過程中勤換手套

? 使用清潔的移液槍

? 只使用 PCR 級(jí)的水和 PCR 專用試劑進(jìn)行 PCR 實(shí)驗(yàn)

? 用帶旋蓋的 EP 管稀釋和配制反應(yīng)液

四、數(shù)據(jù)分析

1．RT－PCR結(jié)束后，我們可以看到整個(gè)擴(kuò)增階段，分為四個(gè)階段，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一個(gè)分析。

2．基線就是擴(kuò)增曲線中的水平部分。

基線：反應(yīng)熒光明顯增加前的背景熒光值。默認(rèn)為3－15Cycles的信號(hào)值。

3．閾值：在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限。

4．CT值是從基線到指數(shù)增長的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

5．Real time PCR 靈敏性強(qiáng)，故對(duì)樣品質(zhì)量及引物質(zhì)量要求很高。為避免非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值不準(zhǔn)確，建議大家在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)都要設(shè)置溶解曲線程序。只有溶解曲線為單一峰，才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。