腈水解酶序列改造，實(shí)現(xiàn)煙酸（維生素B3）高效生物合成

2026-04-27 15:24

一、

文章科普簡(jiǎn)介（此部分由AI生成）

POPOLAR SCIENCE INTRODUCTION

改造酶蛋白，讓煙酸（維生素B3）的生物合成更高效

這是一個(gè)關(guān)于酶“變身變強(qiáng)” 的趣味故事！科學(xué)家利用分步序列優(yōu)化技術(shù)，對(duì)腈水解酶進(jìn)行了不碰核心區(qū)的“遠(yuǎn)端微改造”，一次性解鎖三大超強(qiáng)能力。首先是耐熱體質(zhì)升級(jí)，遠(yuǎn)端突變?cè)诿阜肿觾?nèi)部構(gòu)建了新的鹽橋、π-π 堆積與疏水填充結(jié)構(gòu)，讓酶的寡聚體更緊致、更有剛性，高溫環(huán)境下也不會(huì)輕易散開(kāi)、失活，熱穩(wěn)定性顯著提升。其次是反應(yīng)速度拉滿(mǎn)，突變間接優(yōu)化了底物結(jié)合通道，能穩(wěn)穩(wěn)把底物鎖定在近攻擊構(gòu)象，讓催化路徑更短、反應(yīng)更快，催化效率大幅提高。最后是抗壓能力強(qiáng)化，經(jīng)過(guò)修飾的酶表面大大減少了與煙酸分子的有害結(jié)合，避免產(chǎn)物堵住活性中心、抑制酶活，讓酶可以輕松耐受高濃度煙酸，為高效轉(zhuǎn)化提供堅(jiān)實(shí)保障。這套神奇的遠(yuǎn)端改造，讓普通酶一躍成為煙酸（維生素B3）生物合成的高性能催化劑，不僅活力更強(qiáng)、壽命更長(zhǎng)，還能高效高產(chǎn)煙酸，為工業(yè)生物合成帶來(lái)了更綠色、更高效的新方案。

二、

文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

煙酸又被稱(chēng)為維生素B3、尼克酸、維生素PP，屬于B族維生素，是人體必需的13種維生素之一。煙酸是少數(shù)存在于食物（菌菇、動(dòng)物肝臟、魚(yú)類(lèi)、瘦肉、全谷物、堅(jiān)果等）中且相對(duì)穩(wěn)定的維生素，烹調(diào)及儲(chǔ)存后不易大量流失。煙酸的化學(xué)名稱(chēng)為3-吡啶甲酸，分子式為C6H5NO2。煙酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為煙酰胺，后者是輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）的必需組分。

作為輔酶NAD+和NADP+的必需組分，煙酸是維持正常新陳代謝所必需的，會(huì)參與體內(nèi)糖類(lèi)、脂肪和蛋白質(zhì)的分解代謝及氧化還原反應(yīng)。煙酸缺乏可引起糙皮病，典型癥狀為皮炎、腹瀉及癡呆。此外，大劑量使用煙酸時(shí)還具有調(diào)節(jié)血脂作用，可降低膽固醇和甘油三酯，升高高密度脂蛋白，是重要的調(diào)脂藥物類(lèi)別。

因此，煙酸是食品、飼料、醫(yī)藥領(lǐng)域不可或缺的核心原料，廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化、醫(yī)藥中間體合成及動(dòng)物飼料添加。

此外，煙酸的衍生物煙酰胺單核苷酸（NMN）作為NAD+的高效中間體，近年來(lái)被很多人視為有潛力的抗衰活性物質(zhì)，備受關(guān)注。

目前，生產(chǎn)煙酸的傳統(tǒng)化學(xué)合成法存在高污染、高能耗、反應(yīng)條件苛刻、產(chǎn)物純度低等問(wèn)題，而以腈水解酶為核心的生物催化路線，是煙酸綠色低碳、高效環(huán)保生產(chǎn)工藝的理想方案。但天然腈水解酶普遍存在催化活性低、熱穩(wěn)定性差、可溶性表達(dá)弱等技術(shù)痛點(diǎn)，嚴(yán)重限制工業(yè)化應(yīng)用。

2026年，江南大學(xué)Laichuang Han等（通訊作者為周哲敏教授，zhmzhou@jiangnan.edu.cn）在國(guó)際權(quán)威期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（IF 6.2，農(nóng)林科學(xué)1區(qū)TOP期刊）發(fā)表了題為“Improvement of Activity, Stability, and Soluble Expression of Nitrilase through Stepwise Sequence Optimization for Highly Efficient Synthesis of Nicotinic Acid”的文章。

團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性采用逐步序列優(yōu)化策略，整合PROSS自動(dòng)化組合突變?cè)O(shè)計(jì)與SPIREDFitness適應(yīng)性導(dǎo)向優(yōu)化兩大技術(shù)，對(duì)腈水解酶進(jìn)行精準(zhǔn)遠(yuǎn)端殘基改造，在不改變催化口袋的前提下，成功構(gòu)建出“全能型” 優(yōu)質(zhì)突變體PD1F4，實(shí)現(xiàn)煙酸高效、高耐受、高穩(wěn)定性生物合成，為綠色生物制造產(chǎn)業(yè)提供高性能工業(yè)酶與可復(fù)制的改造范式。

三、

文章摘要

ABSTRACT

本研究針對(duì)天然腈水解酶在煙酸生物合成中活性低、熱穩(wěn)定性差、可溶性表達(dá)弱、產(chǎn)物耐受性低的瓶頸問(wèn)題，采用逐步序列優(yōu)化策略，聯(lián)合 PROSS 組合突變?cè)O(shè)計(jì)與 SPIREDFitness 適應(yīng)性導(dǎo)向優(yōu)化方法，對(duì)腈水解酶突變體 C57E10 進(jìn)行遠(yuǎn)端殘基改造，獲得最優(yōu)突變體PD1F4。

結(jié)果表明，PD1F4較起始突變體比活力提升2 倍以上，50℃半衰期由10.53 min顯著提升至123.40 min，可溶性表達(dá)與產(chǎn)物耐受性大幅改善；全細(xì)胞催化可實(shí)現(xiàn)煙酸終濃度達(dá)272 g/L，且可循環(huán)使用3 輪。分子動(dòng)力學(xué)模擬證實(shí)，遠(yuǎn)端突變通過(guò)穩(wěn)定酶寡聚體結(jié)構(gòu)、鎖定底物近攻擊構(gòu)象、減少酶與產(chǎn)物有害結(jié)合，同步提升酶的催化效率、熱穩(wěn)定性與產(chǎn)物耐受性。該研究提供了高效煙酸合成生物催化劑，建立了可復(fù)制的工業(yè)酶遠(yuǎn)端改造范式，為綠色生物制造提供重要理論與技術(shù)支撐。

四、

思維導(dǎo)圖（此部分由AI生成）

MIND MAP

五、

所用到的主要方法

METHODS

1. 菌株與基因操作方法

2. 計(jì)算機(jī)輔助酶設(shè)計(jì)

3. 實(shí)驗(yàn)篩選與表征

4. 酶學(xué)性質(zhì)分析

5. 放大催化與循環(huán)驗(yàn)證

6. 分子機(jī)制解析

六、

文章的主要內(nèi)容

CONTENTS

本研究以煙酸綠色生物制造為目標(biāo)，選用催化口袋已深度進(jìn)化的腈水解酶突變體C57E10作為起始模板，重點(diǎn)解決其在工業(yè)化應(yīng)用中存在的催化效率不足、熱穩(wěn)定性差、可溶性表達(dá)偏低等關(guān)鍵問(wèn)題。團(tuán)隊(duì)不改變酶的底物特異性與催化中心結(jié)構(gòu)，僅通過(guò)遠(yuǎn)端殘基的逐步序列優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)酶整體性能的全面突破。

1. PROSS 輔助的組合突變?cè)O(shè)計(jì)

研究首先采用PROSS 自動(dòng)化設(shè)計(jì)工具，基于蛋白結(jié)構(gòu)與多序列比對(duì)進(jìn)行組合突變?cè)O(shè)計(jì)，固定催化活性中心與底物結(jié)合口袋，僅對(duì)遠(yuǎn)端位點(diǎn)進(jìn)行突變篩選，最終獲得5點(diǎn)組合突變體PD1。該突變體在催化活性、熱穩(wěn)定性與可溶性表達(dá)三個(gè)維度同步提升，在37℃高溫誘導(dǎo)下仍可保持良好的可溶性，為后續(xù)工業(yè)發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

2. SPIREDFitness 適應(yīng)性導(dǎo)向優(yōu)化

為進(jìn)一步挖掘酶的性能潛力，研究以PD1為模板，引入SPIREDFitness 蛋白大語(yǔ)言模型進(jìn)行適應(yīng)性（Fitness）導(dǎo)向優(yōu)化。通過(guò)全序列單點(diǎn)飽和突變預(yù)測(cè)、多輪迭代組合與高通量篩選，最終獲得最優(yōu)突變體PD1F4。該突變體在保持底物專(zhuān)一性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了活性、穩(wěn)定性、耐受性的三重躍升。

3.純酶學(xué)性質(zhì)表征

系統(tǒng)酶學(xué)表征結(jié)果顯示，PD1F4的比活力較出發(fā)菌株C57E10提升2倍以上；50℃條件下酶活半衰期從10.53 min大幅提升至123.40 min，熱穩(wěn)定性提升超10倍；最適溫度由35℃提高至40℃，更適應(yīng)工業(yè)高溫反應(yīng)環(huán)境。在100 mL 放大體系中，PD1F4全細(xì)胞催化劑可耐受高濃度煙酸積累，終產(chǎn)量達(dá)到272 g/L，遠(yuǎn)高于原始菌株的106 g/L，并可穩(wěn)定重復(fù)使用3個(gè)催化周期，表現(xiàn)出優(yōu)異的工業(yè)應(yīng)用潛力。

4.遠(yuǎn)端突變實(shí)現(xiàn)性能飛躍的機(jī)理解析

為揭示性能提升的分子本質(zhì)，團(tuán)隊(duì)通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬、分子對(duì)接、近攻擊構(gòu)象NAC 分析等手段進(jìn)行機(jī)制解析。研究證實(shí)，遠(yuǎn)端突變通過(guò)新增鹽橋、π-π堆積作用與疏水填充，使酶的寡聚體結(jié)構(gòu)更緊湊、剛性更強(qiáng)，高溫下不易解聚失活；同時(shí)優(yōu)化底物結(jié)合通道，將底物穩(wěn)定在近攻擊構(gòu)象，顯著提高催化效率；此外，突變還降低了酶表面與煙酸分子的有害結(jié)合，大幅提升產(chǎn)物耐受性，從而實(shí)現(xiàn)高濃度高效轉(zhuǎn)化。

（1）穩(wěn)定酶的空間結(jié)構(gòu)：遠(yuǎn)端突變通過(guò)在酶分子內(nèi)部新增鹽橋、π-π堆積作用與疏水填充，使酶的寡聚體結(jié)構(gòu)更加緊湊、剛性更強(qiáng)，有效抑制了高溫條件下酶分子的解聚與失活，顯著提升了熱穩(wěn)定性。

（2）優(yōu)化催化反應(yīng)效率：遠(yuǎn)端突變間接優(yōu)化了底物結(jié)合通道，能夠?qū)⒌孜锓肿臃€(wěn)定在近攻擊構(gòu)象，縮短催化反應(yīng)的反應(yīng)歷程，從而顯著提高催化效率。

（3）提升產(chǎn)物耐受性：突變修飾降低了酶表面與煙酸分子的有害結(jié)合，減少了產(chǎn)物對(duì)酶活性中心的抑制作用，大幅提升了酶對(duì)高濃度煙酸的耐受性，為高濃度產(chǎn)物的高效轉(zhuǎn)化提供了保障。

總之，本研究完整建立了“計(jì)算設(shè)計(jì)-突變構(gòu)建-功能篩選-機(jī)制解析” 的工業(yè)酶改造流程，成功獲得可用于工業(yè)化煙酸生產(chǎn)的高性能腈水解酶突變體PD1F4，同時(shí)提出一套不改動(dòng)催化口袋、僅優(yōu)化遠(yuǎn)端殘基即可突破酶性能瓶頸的通用策略，為腈水解酶及其他工業(yè)酶的定向進(jìn)化提供重要參考與可復(fù)制范式。