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附圖3：NSCLC樣品中EC細(xì)胞的RNA原位雜交結(jié)果

作者使用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析（CyTOF），使用針對(duì)這些細(xì)胞的26種預(yù)選標(biāo)記的金屬結(jié)合抗體，對(duì)從NSCLC樣品中新鮮分離的單個(gè)的癌癥、EC和基質(zhì)細(xì)胞中的標(biāo)記基因的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了定量。

圖3I－K：I：CyTOF數(shù)據(jù)的t－SNE圖，以不同顏色區(qū)分基質(zhì)和癌細(xì)胞表型 

J：通過CyTOF在基質(zhì)細(xì)胞亞群中定量HLA－II表達(dá) 

K：通過scRNA－seq和CyTOF分析鑒定的EC表型的層次聚類 CyTOF識(shí)別的簇以藍(lán)色表示。

圖S4：A－B：根據(jù)CyTOF數(shù)據(jù)進(jìn)行t－SNE后細(xì)胞的來源情況展示 

C－D：t－SNE中不同標(biāo)記蛋白的表達(dá) 

E：EC表型指示標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平條形圖 

F：hTECs和hPNECs中指示標(biāo)記蛋白表達(dá)水平條形圖

CyTOF單細(xì)胞數(shù)據(jù)的無偏聚類和t－SNE可視化揭示了EC，基質(zhì)和癌細(xì)胞的獨(dú)立簇（圖3I和S4A–S4D）

與scRNA－seq一致，作者檢測到I型（vWF－low）和II型（vWF－h(huán)igh）肺泡毛細(xì)血管EC，毛細(xì)血管后靜脈EC（ACKR1－h(huán)igh ／ vWF－h(huán)igh）以及淋巴hPNEC和hTEC表型（PROX1－h(huán)igh）（圖S4E）。

表達(dá)最高CXCR4（tip EC標(biāo)記）水平但下調(diào)毛細(xì)血管標(biāo)志物（CD36，CA4，HLA－II蛋白）的表型可能代表血管生成性hTEC。

檢測到一個(gè)較弱的簇，作者將其認(rèn)定為假定的活化毛細(xì)血管：與I型和II型毛細(xì)管相比，其毛細(xì)血管標(biāo)志物（CA4，CD36，HLA－II）表達(dá)降低，但靜脈TEC標(biāo)志物vWF和tiphTEC標(biāo)志物水平升高 CXCR4（圖3J和S4E）。

CyTOF證實(shí)了毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中HLA和CD36的水平升高，并在hTECs中被下調(diào)（圖3J和S4F）。

為了驗(yàn)證使用scRNA－seq和CyTOF鑒定出的種群一致的觀察結(jié)果，作者使用關(guān)鍵表面標(biāo)記物（STAR方法）進(jìn)行了層次聚類（圖3K）。

LEC和毛細(xì)管EC聚集在一起，靜脈EC與血管生成EC聚集在一起。

值得注意的是，多尺度自舉分析表明，scRNA－seq解析的I型和II型毛細(xì)管EC最類似于其CyTOF對(duì)應(yīng)物，這一結(jié)果在mRNA和蛋白質(zhì)水平上交叉驗(yàn)證了2種不同的毛細(xì)血管表型的存在。

2．EC表型異質(zhì)性可能的臨床意義

盡管所有患者均未接受過早期治療，作者仍在不同EC表型的相對(duì)分?jǐn)?shù)中觀察到了患者間異質(zhì)性（圖4A）。

在hPNEC中，檢出的動(dòng)脈，毛細(xì)血管，靜脈和淋巴EC的比例各不相同，尤其是毛細(xì)hPNEC表型。

在hTECs中，毛細(xì)血管EC的數(shù)量減少了，這一結(jié)果已通過免疫組織化學(xué)證實(shí)（圖4B）， 盡管每個(gè)患者的程度不同。

腺癌中不成熟的hTECs較鱗狀細(xì)胞癌更為豐富。

圖4：A：患者間EC表型的分布情況 

B：以CD31和CD36免疫染色的人腫瘤周圍組織（上）和NSCLC腫瘤（下）照片及定量

為了將EC表型特異性基因標(biāo)記的表達(dá)與NSCLC患者生存相關(guān)聯(lián)，作者利用了癌癥基因組圖譜（TCGA）的1，024個(gè)NSCLC患者的bulk RNA－seq數(shù)據(jù)集。利用公開資源（STAR方法）為每種表型鑒定EC特異性標(biāo)記基因集后，作者使用基因集變異分析（GSVA）對(duì)1，024個(gè)中的每個(gè)標(biāo)記的富集程度進(jìn)行NSCLC患者評(píng)分，并分組進(jìn)行生存分析。

鱗狀（但未見腺癌）的NSCLC患者中擁有表達(dá)高水平的血管生成tipEC，

未成熟，活化的毛細(xì)血管后EC或淋巴TECs基因組特征的部分，這些患者總生存期較短，可能是因?yàn)檫@些特征反映了活躍的血管生成和淋巴瘤傳播（圖4C）。

圖4C：對(duì)于TCGA來源數(shù)據(jù)使用GSVA根據(jù)EC表型分組后生存分析結(jié)果3．其他物種和模型中的肺腫瘤EC表型

為了比較跨物種的肺TEC分類法和模型，以在整合一致性分析中識(shí)別常見的血管生成TEC表型和靶標(biāo)，作者使用了與人類來源相似的分析策略來構(gòu)建了另外2種肺TEC分類法，主要研究了兩種模型中的TEC情況

顯微分離的29，007個(gè)小鼠mNEC和mTEC，其中存在是否接受過抗VEGF治療的分型

來自人肺腫瘤的6，512個(gè)培養(yǎng)的hcTEC。

這兩者均來自于LLC模型，因?yàn)樗�依賴于血管生成血管萌芽（AAT的靶標(biāo)），這與其他臨床前小鼠NSCLC腫瘤模型不同。

與在人肺中一樣，作者鑒定了富集到的mNEC的表型，這些表型分別表達(dá)動(dòng)脈（M1），I型和II型肺泡毛細(xì)血管（M2，M3），靜脈（M4）和淋巴性（M5）EC的典型標(biāo)志物（圖5A－5D和S5A  –S5G）。

圖5：A：小鼠模型實(shí)驗(yàn)流程 B：不同來源的EC在t－SNE分布情況 

C：整合后的t－SNE圖（對(duì)不同亞群進(jìn)行顏色注釋） 

D：t－SNE聚類后的亞群標(biāo)記基因的表達(dá)分布情況

圖S5：A：mTECs和mNECs中EC表型的相對(duì)豐度。 

BC：標(biāo)記基因在不同亞組中的表達(dá)熱圖 

D：所有已鑒定的mNEC和mTEC表型的不同基因表達(dá)譜的相關(guān)性熱圖 

E：在hTECs和hpNECs不同EC亞型的占比 

F：hTEC和hpNEC對(duì)不同亞型的貢獻(xiàn)情況

圖S5：G：在患者標(biāo)本中對(duì)于所有細(xì)胞的聚類結(jié)果 

H：mNEC和mTEC的t－SNE圖（H2－Aa和H2－Ab基因的） 

在鼠肺EC表型中所示的常駐內(nèi)皮干細(xì)胞（ESC）標(biāo)志物表達(dá)水平的熱圖。 

J－K：Glycam1基因或HEV標(biāo)記基因集的顏色編碼的mNEC和mTEC的t－SNE圖

II型肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)參與MHC－II抗原呈遞，加工和負(fù)載的基因水平最高（圖S5B和S5H），但不表達(dá)共刺激基因Cd80和Cd86。

與NSCLC一樣，在腫瘤中毛細(xì)血管EC的比例不足（圖S5A；表S3），mTEC中典型的毛細(xì)血管基因特征表達(dá)下調(diào)，包括MHC－II表達(dá)（圖S5H）。

除了一個(gè)毛細(xì)血管TEC表型（M6）外，mTECs下調(diào)了Cd36（一種涉及脂肪酸攝取的基因）（圖5D）

與人肺不同，鼠肺中的靜脈EC表型表達(dá)了先前在大型肺血管中發(fā)現(xiàn)的常駐內(nèi)皮干細(xì)胞標(biāo)志物（Cd200， Bst1）（圖S5I）。

檢測到增殖的（M7）和tip的（M8）mTEC（圖5C和5E）。鼠肺中增殖的mTECs比人肺腫瘤中的豐富，這與鼠肺腫瘤的更快生長以及NSCLC中可能的不同類型腫瘤血管形成相一致（圖5D和S5E）。

檢測到不成熟的mTEC表型（M9）（圖5C）。

與人類EC一致，觀察到高靜脈可塑性并檢測到TEC豐富的表型，包括大靜脈EC（M10）和毛細(xì)血管后靜脈EC（M11）（圖5C）。