大腸桿菌中L-蘇氨酸生物合成途徑的聯(lián)合代謝分析

2024-06-24 16:49

文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

L-蘇氨酸(Threonine,Thr)是人體自身無(wú)法合成，必須從食物中攝取的8種必需氨基酸之一，是蛋白質(zhì)合成的重要組成成分，廣泛應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，常添加到未成熟仔豬和家禽飼料中，是豬飼料中的第二限制性氨基酸和家禽飼料中的第三限制性氨基酸。目前生產(chǎn)蘇氨酸的方法主要有動(dòng)物蛋白水解和微生物發(fā)酵兩種。與前者相比，微生物發(fā)酵法具有成本低、污染少等優(yōu)點(diǎn)。在蘇氨酸生產(chǎn)過(guò)程中，大腸桿菌是主要的宿主。這歸因于其簡(jiǎn)單的遺傳背景和方便通過(guò)代謝工程修飾。此外，它具有生長(zhǎng)周期短、細(xì)胞強(qiáng)度高、對(duì)設(shè)備要求低等特點(diǎn)。Thr的高效合成不僅依賴于某一特定限速反應(yīng)效率的大幅提高，還需要生物合成網(wǎng)絡(luò)中多種代謝途徑的平衡，如強(qiáng)化靶代謝流、削弱競(jìng)爭(zhēng)性分支代謝流、提高細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)效率等。

代謝通量分析(Metabolic flux analysis, MFA)是一種通過(guò)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)化學(xué)計(jì)量模型的代謝網(wǎng)絡(luò)分析方法，該模型基于偽穩(wěn)態(tài)假設(shè)，即所有代謝物的代謝通量分布是在代謝途徑中生產(chǎn)速率和消耗速率之間的動(dòng)態(tài)平衡中估計(jì)的。該方法已成功應(yīng)用于某些氨基酸的代謝分析，并顯著節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。由于代謝途徑中代謝物的合成受多種酶催化反應(yīng)的控制，因此有必要研究這些酶對(duì)碳通量的控制作用。代謝控制理論認(rèn)為，每一步代謝途徑反應(yīng)的變化都會(huì)引起系統(tǒng)參數(shù)的變化，因此代謝途徑中生化反應(yīng)沒(méi)有穩(wěn)定的限速步驟。

通量控制系數(shù)(FCC)和彈性系數(shù)構(gòu)成了代謝控制分析的遺傳理論，描述了整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中的全局參數(shù)，是酶活性與代謝通量之間的橋梁。細(xì)胞代謝分析的另一種方法依賴于代謝組學(xué)技術(shù)，通過(guò)GC/MS或LC/MS檢測(cè)代謝物的變化，準(zhǔn)確反映不同條件下的代謝變化。因此，為了探究聯(lián)合代謝分析是否可以指導(dǎo)大腸桿菌提高Thr的產(chǎn)量，江南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院的Qiang Yang等人開(kāi)展了相關(guān)研究，并于2022年在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》雜志（IF=5.7；JCR Q1；中科院工程技術(shù)類(lèi)2區(qū)）發(fā)表了題為“Combined metabolic analyses for the biosynthesis pathway of L-threonine in Escherichia coli”的文章。

所用到的主要方法

METHODS

（1）補(bǔ)料分批發(fā)酵

（2）內(nèi)標(biāo)法定量

（3）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)

（4）高效液相色譜

（5）生物傳感器測(cè)定代謝物

（6）考馬斯亮藍(lán)G250染色法

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

目前，工業(yè)生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法主要是利用大腸桿菌等微生物直接發(fā)酵，具有成本低、生產(chǎn)率高的特點(diǎn)。為了闡明大腸桿菌蘇氨酸合成途徑的關(guān)鍵代謝特征，為該菌株的代謝調(diào)控或工程化提供線索，研究者以菌株W3110為對(duì)照對(duì)一株L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株E.coliTWF001進(jìn)行了代謝通量、酶控和代謝組學(xué)分析。通過(guò)GC-MS檢測(cè)，對(duì)代謝物進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果表明菌株TWF001和W3110在氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸、糖、醇等物質(zhì)含量方面的確存在顯著差異。與對(duì)照菌株W3110相比，TWF001的L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和脂肪酸化合物含量顯著降低。而TWF001產(chǎn)生的蘇氨酸含量較高，其他副產(chǎn)物氨基酸的碳代謝流量較少。由于環(huán)境干擾和基因改造是兩種重要的代謝分析方法，因此選擇在培養(yǎng)基中添加磷酸鹽和比較不同基因型菌株作為兩種候選方法。通過(guò)對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、酶和生物標(biāo)記物等重要靶點(diǎn)的鑒定，為菌種的合理設(shè)計(jì)提供了靶點(diǎn)。最后以該研究中確定的一種生物標(biāo)志物為例進(jìn)行代謝調(diào)控，證實(shí)了聯(lián)合代謝分析可以指導(dǎo)大腸桿菌提高蘇氨酸的產(chǎn)量。

簡(jiǎn)而言之，本研究的主要內(nèi)容有：

1、Thr生物合成途徑代謝分析

2、PEPC、PK、G6PD、FBA、MDH等酶可以作為蘇氨酸代謝通量的描述性指標(biāo)

3、磷酸鹽作為環(huán)境干擾物會(huì)影響Thr的積累

4、E. coli TWF001和W3110在各代謝物含量方面存在顯著差異

5、在培養(yǎng)基中加入L-谷氨酸,證實(shí)L-谷氨酸可能通過(guò)將代謝流遷移而不是增加生物量來(lái)提高Thr的產(chǎn)量